Este artículo es parte de la edición de julio, 2013

Mecanismo de acción de vacunas vectoriales HVT+IBD*, vacunas vectoriales HVT-ND y de inmunocomplejos frente a IBD

Michel Bublot, Merial R&D**

Merial Avian Forum 2013, Estambul 17-19 Abril

Introducción

Para entender cómo funcionan las vacunas es importante conocer la biología del agente de que se trate y los diferentes tipos de vacunas.

La bolsa de Fabricio y la enfermedad de Gumboro

La bolsa de Fabricio es un órgano linfoide primario, crítico para el normal desarrollo de la producción de anticuerpos. Es un órgano único en las aves y desde hace más de 50 años se sabe que es el punto primario para la linfopoyesis de las células B y en donde se producen los linfocitos B maduros, responsables de la diversidad de anticuerpos. También actúa como órgano linfoide secundario, ya que a partir de los linfocitos B, dará lugar a los plasmocitos y a la producción de anticuerpos -Jeurissen et al., 1994; Davison et al. 2008-.

Su involución comienza a las 8-10 semanas y en algunos casos puede llegar a verse hasta los 6-7 meses.

La enfermedad de Gumboro es una de las enfermedades económicamente más importantes que afectan a las aves producidas comercialmente en todo el mundo -Müller et al., 2012-.

El virus de la enfermedad de Gumboro -IBDV- es un virus sin envuelta que inicialmente se replica en los macrófagos de los tejidos asociados al intestino, y luego principalmente en linfocitos B proliferantes de la bolsa de Fabricio, lo que causa lesiones bursales e inmunosupresión -Müller et al., 1979-. De la misma forma que muchos virus sin envuelta, el IBDV es muy sensible a los anticuerpos neutralizantes que constituyen el componente más importante de la respuesta inmune protectora frente a IBD.

(*) Vaxxitek® HVT+IBD, Merial Laboratorios S.A.

(**) Traducido por Javier Torrubia, Merial Laboratorios S.A.

Vacunas contra la enfermedad de Gumboro

De las vacunas clásicas empleadas desde hace bastante tiempo frente a IBD, hay que destacar 3 puntos principales:

  1. Su administración mediante el agua de bebida.
  2. Su relativa inseguridad, ya que en mayor o menor medida van a causar alguna lesión en la bolsa de Fabricio y según sea de grave, cierto grado de inmunodepresión.
  3. Su eficacia depende del grado de atenuación, que a su vez determina que sean capaces de sobrepasar un determinado nivel de anticuerpos maternos –MDA- pero que siempre muestran un tiempo de “vacío inmunitario” desde que no son afectadas por los MDA hasta que empiezan a ejercer su protección.

Vacunación en la incubadora

Las ventajas de la vacunación en la incubadora han llevado al desarrollo de nuevas vacunas a ser administradas vía in ovo o al nacimiento. En 1985 se fundó la compañía Embrex que desarrolló la máquina para vacunación in ovo. J. Sharma, en 1985, halló que la cepa intermedia-plus Winterfield 2512 (W2512) del IBDV era eficaz en pollos de engorde con MDA usando la vacunación vía in ovo o al nacimiento -ver tabla 1-.

Concluye que las vacunas suaves de IBD son sensibles a los anticuerpos maternos -MDA- y que las vacunas Intermedias plus, eficaces en aves con MDA, no son seguras en aves SPF, pero su seguridad se vio aumentada cuando el virus W2512 se mezcló con un suero de pollo que contenía anticuerpos neutralizantes frente al IBDV.

La denominada vacuna de inmunocomplejos –ICx- fue desarrollada por Embrex y obtuvo la autorización del USDA en 1995 -Whitfill et al.-. La nueva vacuna fue hecha mediante la mezcla del virus vivo de Gumboro con anticuerpos contra el virus de Gumboro presentes en antisuero, que se administró al día de edad por vía SC en pollos SPF -ver tabla 2-.

La adición de anticuerpos al virus de Gumboro origina un complejo vacunal que permite una inmunización más segura en aves SPF que la administración de virus vacunal sin los anticuerpos.

Jeurissen et al. –1998- hallaron que los anticuerpos presentes en la vacuna de ICx administrada in ovo retrasaban en unos 5 días la infección de las células B, macrófagos y células dendríticas foliculares –FDC- en la bolsa y en el bazo de pollos SPF -ver tabla 3-.

De estos resultados se llega a la hipótesis de que el mecanismo de acción de la vacuna ICx está relacionado con su interacción específica celular con las FDC en bazo y bolsa.

En pollos de engorde con MDA, el papel de los anticuerpos de la vacuna ICx es menos claro, ya que no se observaron diferencias en las lesiones bursales inducidas por la vacuna y/o la protección entre la vacuna ICx administrada por vía SC y la cepa W2512 administrada por vía oral a los días D1 y D7 -Haddad et al, 1997-. Corley et al. –2002- aplica la cepa W2512 sola o en forma de ICx vía in ovo en animales con bajos niveles de MDA, pareciendo que ICx es algo más segura que la cepa vacunal sola -solo a los 39 días- y se retrasa algo la replicación de la cepa -ver tabla 4-.

Por tanto, se podría concluir que tanto la cepa W2512 sola como en forma de ICx, pueden inducir atrofia bursal.

En cuanto a eficacia, Johnston et al. –1997- y Haddad et al. –1997- vacunaron aves por vía in ovo o al primer día por vía SC, con la cepa W2512, bien sola o en forma de ICx, sometiendo los pollos a desafío a los 21 o 35 días respectivamente. Hubo un alto porcentaje de protección en los grupos de control y la valoración de la eficacia no es fácil de hacer debido a las lesiones de la bolsa inducidas por la cepa vacunal. En cualquier caso, no parece haber una ventaja clara de la vacuna ICx en comparación a la misma cepa sola -ver tabla 5-.

Sobre la producción de anticuerpos, Johnston et al. –1997- y Haddad et al. –1997- midieron la respuesta de anticuerpos mediante ELISA IBD –Iddex-. de animales vacunados respectivamente in ovo o al día de edad por vía SC. Hubo mayores títulos ELISA IBD con la vacuna ICx al día 42 en los vacunados in ovo, pero no en los vacunados por vía SC -ver tabla 6 y figura 1-.

Fig1_evolucion_opt.jpeg

Fig. 1. Evolución de anticuerpos

Esto indica la posible presencia de un período de “vacío inmunitario” que igualmente ha sido demostrado por Prandini et al. –2008-. La cinética de los anticuerpos en pollos de engorde indica la presencia de un vacío inmunitario antes de la inducción de una respuesta inmune protectora.

Por todo ello se puede concluir que las vacunas de inmunocomplejos cumplen el requisito para el que fueron creadas de adaptarse a la vacunación en la incubadora, pero en cuanto a seguridad, si bien algunos estudios han demostrado que no causan lesiones significativas en la bolsa de Fabricio, en otros estudios se demuestra que para inducir una respuesta inmune protectora contra IBD, el IBDV de la vacuna ICx necesita primero replicarse en la bolsa, lo que causará lesiones significativas e inmuno-supresión. Sobre la eficacia, si bien algunos demuestran su eficacia, queda la duda del período de “vacío inmunitario”.

Tabla 1. Seguridad y eficacia de cepas vacunales de IBDV (*)

(*) Sharma 1985

Vacuna

Aves

Seguridad In ovo

Eficacia In ovo

Eficacia a 1 día

BVM/TC

(suave)

SPF

OK

93/100%

100/100%

MDA+

OK

30/100%

30/56%

W-2512

(interm.+)

SPF

36% †

MDA+

OK

92%

92%

Tabla 2. Relación peso Bursal/corporal de la misma cepa con/sin anticuerpos (*)

Vacuna

Anticuerpos

Día 9

Día 21

3,5

4,8

W-2512

1,7

1,6

W-2512

+

3,3

1,6

W-2512

+++

3,8

3,9

 

SEGURIDAD

POTENCIA

(*) Whitfill 1995

Tabla 3. Detección IBDV vacunal de la cepa original y combinada en ICx (*)

Vacuna

1 día edad

3 días edad

5 días edad

8 días edad

12 días edad

V877

+++

+++

+++

+

V877 ICx

±

+++

++

(*) Jeurissen 1998

Tabla 4. Relación peso bolsa/cuerpo de la cepa original y combinada en ICx (*)

Vacuna

Seguridad In ovo

Relación peso bolsa/cuerpo a D25 (&)

Estudio Corley

Seguridad In ovo

Relación peso bolsa/cuerpo a D 39 (&)

Estudio Corley

Seguridad SC 1 día

Relación peso bolsa/cuerpo a D35

Estudio Haddad

3,27 ± 0.2a

2,22 ± 0.2a

2,54 ± 0.7a

W2512

2,65 ± 0.2a

1,07 ± 0.2b

1,06 ± 0.7b

W2512 ICx

2,69 ± 0.1a

2,17 ± 0.1a

0,82 ± 0.2b

(*) Corley 2002, Haddad 1997

(&) Broilers con bajos MDA

Tabla 5. Eficacia de la cepa original y combinada en ICx (*)

Vacuna

In ovo eficacia a 21 días (medida por mortalidad 7 días post desafío)

Estudio Johnston

SC Eficacia a 35 días (medida por % de bolsas con lesiones 3 días post desafío)

Estudio Haddad

80%

44%

W2512

100%

100%

W2512 ICx

100%

100%

(*) Johnston 1997 y Haddad 1997

Tabla 6. Títulos de anticuerpos

Vacuna

In ovo D42

SC D35

W2512

1149

1738

W2512 ICx

2211

1514

Vacunas vectoriales

Las vacunas vectoriales frente a IBDV con base en el Herpesvirus de pavo -HVT- -vHVT-IBDV- tienen un modo de acción totalmente diferente de la vacuna ICx. El vector HVT -Herpes virus de pavo, no patógeno para las aves, del que se han usado miles de millones de dosis desde la década de 1970-, se replica y persiste en los linfocitos T -Shek et al., 1982-. El gen que codifica para la proteína protectora VP2 del IBDV fue insertado en el genoma del vector por debajo de un fuerte promotor que está activo durante la replicación del HVT. Las principales células diana en donde se replica el vector HVT no son células B ni macrófagos. La replicación del vector HVT se inicia justo después de la vacunación ya que los MDA no inhiben la replicación de HVT. La proteína VP2 se expresa durante la replicación in vivo del vHVT-IBD y se presenta al sistema inmunitario. La cinética y larga persistencia de los anticuerpos anti-VP2 sugieren que la VP2 se expresa continuamente en los pollos vacunados.

La replicación del vHVT-IBDV no afecta la integridad de la bolsa de Fabricio. Curiosamente y a diferencia de todas las demás vacunas vivas atenuadas frente a IBDV probadas, no se observa ningún vacío inmunitario en la respuesta de anticuerpos VP2.

Prandini et al. –2008- demostraron la continua producción de anticuerpos anti VP2 y la temprana inducción de anticuerpos protectivos, que evita el vacío inmunitario -ver figura 2-.

El vector HVT induce una fuerte inmunidad sistémica que es óptima para controlar una enfermedad sistémica como la enfermedad de Gumboro.

Se puede por tanto resumir en las tablas 7 y 8 las características y las mejoras se han obtenido con las vacunas más recientes contra la enfermedad de Gumboro, concluyendo que las más significativas se han obtenido con la vacuna vectorial HVT-IBD.

Tabla 7. Resumen de las características de las vacunas ICx y vHVT-IBDV

 

Vacuna de inmunocomplejos

Vacuna vectorial HVT-IBD

Indicado en aves

Únicamente en broilers con MDA,

Broilers, ponedoras, reproductoras

Ingrediente activo

W2512 IBDV Intermedia plus

Vector HVT apatógeno

Sitio de replicación

Linfocitos B de la bolsa

 

Linfocitos T, folículos plumíferos

Efecto de anticuerpos maternos (MDA)

 

Replicación de W2512 retrasada por los MDA

Replicación de HVT y expresión de VP2 no influida por MDA

Inducción de inmunidad

Respuesta inmune ocurre tras la replicación viral en células B de la bolsa

Expresión prolongada de VP2

que es presentada al sistema

inmune

Vacío inmunitario entre disminución MDA e inmunidad activa

Sí, debido a retraso en la replicación y en la respuesta inmune

No, debido a la expresión prolongada de VP2

 

Inmunosupresión

Severas lesiones bursales que pue-den conducir a inmunodepresión

No hay inmunodepresión inducida por HVT; total integridad de la bolsa

Tabla 8. Mejoras de las vacunas de IBD

Tipos de vacunas

clásicas de IBD 1970s

de Inmuno-complejos 1995

Vectorial HVT 2006

Administración en la incubadora

+

+

Seguridad

+

Vacío inmunitario

+

Enfermedad de Newcastle

Es importante recordar que existen 3 patotipos:

  1. Lentogénicos: que producen sintomatología respiratoria/entérica
  2. Mesogénicos: que producen sintomatología respiratoria y afectan a la calidad del huevo
  3. Velogénicos: los más graves, que producen sintomatología respiratoria, nerviosa y también afectan a la calidad del huevo

El virus NDV tiene tropismo por las mucosas respiratorias, de hecho se le considera uno de los componentes del complejo respiratorio. Por ello, se requiere una inmunidad de las mucosas para obtener una protección óptima frente a ND.

Vacunas contra NDV e inmunidad

En la tabla 9 se resumen las características de las vacunas empleadas clásicamente para luchar contra la enfermedad de Newcastle.

Hasta ahora solo la combinación de vacunas vivas modificadas e inactivadas induce una inmunidad óptima.

Sin embargo, las vacunas clásicas frente a NDV tienen unas determinadas limitaciones. Así, algunas de las vacunas vivas modificadas muestran una deficiencia en su seguridad, ya que pueden producir reacciones respiratorias -sobre todo las derivadas de la cepa La Sota- y además requieren revacunaciones en campo.

titulos_anticuerpos_opt.jpeg

Fig. 2. Títulos de anticuerpos VP2 con ELISA IBD Plus (Prandini 2008)

Las vacunas inactivadas, por su parte, no pueden administrarse in ovo y al tratarse de emulsiones su administración debe hacerse de forma individual y pueden causar reacciones locales en el punto de inoculación.

Para tratar de obviar esas limitaciones, para controlar la ND también han sido desarrolladas vacunas vectoriales basadas en el virus HVT como vector.

En la estructura del virus de Newcastle, se distinguen diferentes proteínas estructurales, de las cuales las 2 que están en la cubierta son las que se consideran protectivas, concretamente la HN -hemaglutinina-neuraminidasa- que permite al virus adherirse a la membrana celular huésped y la F -de fusión- que una vez adheridas, permite su fusión y la penetración del virus -ver figura 3-.

Morgan et al. –1992- desarrolló la vacuna vectorial utilizando el mismo vector HVT que expresa la proteína de fusión F del virus de la enfermedad de Newcastle -vHVT-NDV-, después de comprobar que la proteína F era más efectiva que la HN en la protección de las aves -ver tabla 10-.

Así, las vacunas vHVT-NDV han demostrado proteger contra la infección sistémica por virus velogénicos NDV, pero la protección local frente a la replicación del NDV en la tráquea es baja, lo que provoca una pobre inducción de inmunidad mucosa.

Además, la aparición de la inmunidad se ve retrasada en comparación con las vacunas vivas modificadas –MLV- tal como han demostrado Morgan et al. –1993-, que determinaron que el comienzo de la protección tras la aplicación al día de edad de la vacuna recombinante HVT/F y el subsecuente desafío ocular con la cepa velogénica neurotrópica Texas GB, ocurría entre el dia 14 y 21 tras la vacunación, mientras que la vacunación con la cepa viva Hitchner B1 resultó en protección al día 6 tras la vacunación. Heckert et al -1996- observaron que la vacuna recombinante proporcionaba protección en aumento a medida que el desafío se iba haciendo más tarde.

Hein et al. –2008- mostraron la protección conseguida con la vacuna recombinante y la vacuna viva ND cuando el desafío con una cepa velogénica se hizo a los días 8, 22 o 36 días en broilers comerciales con MDA -ver tabla 11-.

Se ha demostrado en estudios de campo que se requiere al menos una administración de vacunas MLV para obtener inmunidad mucosa, además de la vHVT-NDV, para inducir una mejor y más temprana respuesta inmuno-protectora.

Rauw et al. –2010 – observaron mayor inmunidad cuando se aplicó la combinación rHVT-ND/vacuna viva ND, en comparación a la aplicación de cualquiera de las 2 vacunas por separado. Ya fuera la recombinante rHVT-ND o la vacuna viva de ND.

Fig_3_esquema_de_virus_opt.jpeg

Fig. 3. Esquema de virus de ND y sus proteínas estructurales (F.L. Institute, Riems, Alemania.)

Vacunas e inmunidad ante NDV

La combinación de vacunas vivas modificadas junto a las vacunas vectoriales HVT-ND induce amplia inmunidad, pero una respuesta de anticuerpos más baja que la combinación de vacunas vivas modificadas y vacunas inactivadas. Ante una grave infección de campo, sigue permaneciendo la duda de si la vacuna vectorial HVT-ND + vacunas vivas, es tan eficaz como las vacunas vivas modificadas + vacunas inactivadas -ver tabla 12-.

Conclusiones

  • Aunque es excelente para proteger contra enfermedades sistémicas como la enfermedad de Gumboro, el vector HVT tiene algunas limitaciones cuando se utiliza contra enfermedades respiratorias.
  • Las vacunas de inmunocomplejos ICx IBD no resuelven los problemas de vacío inmunitario y de seguridad, ligados a las vacunas vivas modificadas de IBD.
  • Las vacunas vHVT-ND no reemplazan a las vacunas vivas modificadas de ND y pueden no ser tan protectoras como la combinación de vacunas Inactivadas+MLV
  • La vacuna vectorial vHVT-IBD reemplaza a las vacunas vivas modificadas de IBD y resuelve los problemas de vacío inmunitario y de seguridad, ligados a las vacunas vivas modificadas de IBD.

Tabla 9. Características de las vacunas clásicas frente a ND

Inmunidad

Vivas modificadas (MLV)

Inactivadas (K)

MLV+K

Comienzo

+++

+

+++

Mucosa

+++

+

+++

Celular

++

+

+++

Humoral

+

+++

+++

Duración

+

+++

+++

Tabla 10. Protección ante desafío a los 28 días con la cepa velogénica GB-Tx, tras la vacunación al día de edad. (*)

Vacuna

Desafío

Protección sistémica (&)

Protección local ($)

HVT-ND (IA)

IM

96%

88%

HVT-ND (IA)

Ocular

96%

16%

HB1 (IO)

IM

88%

100%

HB1 (IO)

Ocular

100%

100%

IM

0%

Ocular

0%

0%

(*) Morgan 1992

(&) % de protección de signos neurotrópicos y mortalidad); ($) % de vivos 5 días post desafío negativos a virus GB-Tx en tráquea

Tabla 11. Protección ante desafío con cepa velogénica (*)

Vacuna

Protección a 8 dpv

Protección a 22 dpv

Protección a 36 dpv

HVT-ND

30%

65%

100%

HVT-ND + vacuna viva ND

100%

100%

100%

Vacuna viva ND

100%

80%

40%

Control

60%

0%

10%

(*) Hein 2008

Tabla 12. Resumen de características de vacunas contra ND

Inmunidad

Vivas Modif. (MLV)

HVT-ND

MLV+HVT-ND

MLV+K

Comienzo

+++

+

+++

+++

Mucosa

+++

+

+++

+++

Celular

++

++

+++

+++

Humoral

+

+

+

+++

Duración

+

+++

+++

+++

Bibliografía

  1. Corley M., Giambrone J. and Dormitorio T., 2002. Evaluation of the Immune Response and Detection of Infectious Bursal Disease Viruses by Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay after in ovo Vaccination of Commercial Broilers, Avian Dis 46:803
  2. Davison, Kaspers, Schat & Kaiser, 2008. Avian Immunology, Academic press.
  3. Haddad E. E., Whitfill C. E., Avakian A. P., Ricks C. A., Andrews P. D., Thoma and Wakenell P. S. 1997. Efficacy of a Novel Infectious Bursal Disease Virus Immune Complex Vaccine in Broiler Chickens. Avian Dis., 41:882.
  4. Heckert R., Riva J., Cook S., McMillen J. and Schwartz R., 1996. Onset of Protective Immunity in Chicks after Vaccination with a Recombinant Herpesvirus of Turkeys Vaccine Expressing Newcastle Disease Virus Fusion and Hemagglutinin-Neuraminidase Antigens, Avian Dis., 40; 776.
  5. Hein R., Rios F., Mebatsion T., 2008; Newcastle disease (ND) efficacy in broilers vaccinated at 1 day of age with the recombinant HVT/F(ND), 8th Intl MD Meeting, Townsville, Australia.
  6. Jeurissen, S., Janse E., Lehrbach P., Haddad E., Avakian A., and Whitfill C. The working mechanism of an immune complex vaccine that protects chickens against infectious bursal disease. Immunology 95:494-500. 1998.
  7. Jeurissen, S. H. M., L. Vervelde, and E. M. Janse. Structure and function of lymphoid tissues in the chicken. Poult. Sci. Rev., 5:183. 1994.
  8. Johnston P., Liu H., O’connell T., Phelps P., Bland M., Tyczkowski J., Kemper A., Harding T., Avakian A., Haddad E., Whitfill C., Gildersleeve R., and Ricks C. A., 1997.Applications in In Ovo Technology, Poultry Sci., 76:165 .
  9. Morgan R., Gelb J., Schreurs C., Lütticken D., Rosenberger J. and Sondermeijer P., 1992. Efficacy in Chickens of a Herpesvirus of Turkeys Recombinant Vaccine Containing the Fusion Gene of Newcastle Disease Virus: Onset of Protection and Effect of Maternal Antibodies, Avian Dis., 36, 858).
  10. Müller R., Käufer I., Reinacher M., Weiss E., 1979. Immunofluorescent studies of early virus propagation after oral infection with infectious bursal disease virus (IBDV), Zentralbl. Veterinarmed B. 26:345.
  11. Müller H., Mundt E., Eterradossi N.& Islam R., 2012. Current status of vaccines against infectious bursal disease, Avian Pathol. 41:133
  12. Prandini F., Bublot M., Le Gros F.-X., Dancer A., Pizzoni L., Lamichhane C., 2008. Assessment of the immune response in broilers and pullets using two ELISA kits after in ovo or day-old vaccination with a vectored HVT + IBD vaccine (VAXXITEK® HVT+IBD), Zootecnica Sept.
  13. Rauw F., Gardin Y., Palya V., Anbari S., Lemaire S., Boschmans M., van den Berg T., Lambrecht B., 2010; Improved vaccination against Newcastle disease by an in ovo recombinant HVT-ND combined with an adjuvanted live vaccine at day-old, Vaccine 28:823.
  14. Sharma J., 1985; Embryo Vaccination with Infectious Bursal Disease Virus Alone or in Combination with Marek’s Disease Vaccine, Avian Dis. 29:155
  15. Shrek W., Schat K., Calnek W., 1982; Characterization of Non-oncogenic Marek’s Disease Virus-infected and Turkey Herpesvirus-infected Lymphocytes, J. Gen Virol. 63:333.
  16. Whitfill C., Haddad E., Ricks C., Skeeles J., Newberry L., Beasley J., Andrews P., Thoma J. and Wakenell P., 1995. Determination of Optimum Formulation of a Novel Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) Vaccine Constructed by Mixing Bursal Disease Antibody with IBDV, Avian Dis., 39:687.
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