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SUSCRIBIRSEEste artículo es parte de la edición de enero, 2012
PATOLOGÍA
Los resultados serológicos. Limitaciones y aplicaciones prácticas para la enfermedad de Gumboro
Javier Torrubia Díaz
Director Técnico Avicultura, Merial laboratorios S.A.
Introducción
La serología es una herramienta fundamental y clásica en un programa de medicina preventiva; los datos obtenidos deben ser comparados frecuentemente, de forma que sea una herramienta dinámica que nos pueda mostrar los cambios de situación en cada granja o explotación relativos al nivel y al tipo de desafío.
Las pruebas serológicas detectan las respuestas humorales de anticuerpos en el huésped frente a diferentes antígenos; las pruebas usualmente detectan anticuerpos séricos
Pruebas serológicas cualitativas
Las pruebas serológicas pueden ser cuantitativas o cualitativas. En las pruebas cualitativas, como la aglu- tinación en placa o la inmunodifusión en gel de agar, el resultado se expresa como positivo o negativo. En gene- ral, estas pruebas suelen ser poco sensibles y el suero normalmente no se diluye para ser procesado.
Pruebas serológicas cuantitativas
Las pruebas cuantitativas permiten detectar la can- tidad de anticuerpos que hay en la muestra; en el caso de la inhibición de la hemoaglutinación, la microaglutinación y la seroneutralización los sueros se diluyen en diluciones dobles seriadas y el resultado usualmente se expresa como el «título», que indica la
dilución mayor en la que se observa una reacción positiva. El título es proporcional a la cantidad de anticuerpos que hay en la muestra y el resultado se expresa como la dilución, ej. 1:256 o su inverso ej. 256, aunque también se pueden expresar en forma de Logaritmo en base 2, por ejemplo, 1:256 = Log2 8.
En otros casos, como en las pruebas ELISA, el suero sólo es diluido una vez antes de ser procesado y se utiliza un antisuero marcado con una enzima. El resultado se basa en una reacción colorimétrica que es medida con un espectrofotómetro, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpos de la muestra y el titulo es calculado matemáticamente haciendo una compara- ción con los títulos de los controles positivos y negati- vos. Los resultados son además clasificados en «grupos o perfiles» en un histograma, ya que la expresión gráfica de los resultados facilita en gran medida su interpretación.
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LOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBORO
Seroneutralización
Dentro de las pruebas serológicas cuantitativas, la seroneutralización está considerada de referencia para cualquier estudio serológico pues es la que más se correlaciona entre la respuesta «in vitro» y la respuesta «in vivo». En esta prueba se puede valorar la capacidad que tienen los anticuerpos presentes en un suero proble- ma para neutralizar la actividad biológica de un antígeno. Se añade una mezcla de virus a una concen- tración constante que previamente ha estado en con- tacto con diferentes diluciones del suero problema sobre las células. Se van observando las células sobre la que se han añadidos las distintas diluciones para ver si el virus las ha infectado o no mediante la tinción con un conju- gado o por el efecto citopático. De esta forma se puede medir la capacidad de neutralización viral de un suero problema.
La prueba de seroneutralización es, sin duda algu- na, la más fiable, pero su complejidad, laboriosidad y elevado coste, hace que se deje para investigación o trabajos muy específicos. Se tiende a emplear pruebas menos exactas, pero más sencillas y sobre todo, más fáciles de automatizar.
Inhibición de la hemoaglutinación
Esta prueba se basa en la característica de algunos microorganismosquesoncapacesdeaglutinareritrocitos de mamíferos o aves, lo que puede utilizarse para carac- terizar virus, o medir anticuerpos en suero, por ejemplo: Orthomyxovirus, Paramyxovirus y Coronavirus, así como Mycoplasma.
Consiste en enfrentar diluciones seriadas de una muestra frente a un antígeno con un título determinado hasta que no se produce reacción
Fig. 1. Placa de Inhibición de la hemoaglutinación
Aunque es más laboriosa y menos automatizable que ELISA, es preferida su utilización para algunas enferme- dades como EDS y bronquitis infecciosa en la que la abundancia de serotipos permite la aplicación de los diferentes antígenos, frente a ELISA ya que los kits disponibles comercialmente, normalmente se restrin- gen a un solo antígeno.
ELISA
El término ELISA, acrónimo de
Las enzimas sirven como marcadores debido a que cuando se combinan con su sustrato producen un cambio de color que hace la reacción visible, pudiéndose cuantificar bien por diluciones o por la lectura espectrofotométrica de la intensidad del color y medir su intensidad. No requieren instrumentos sofisticados.
Los kits ELISA proporcionan varios valores, como son la Media Geométrica del Titulo
Fig. 1. Placa de ELISA
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El tercer valor es el coeficiente de variación
La principal ventaja de la prueba ELISA es la capacidad de automatización y de procesamiento de grandes can- tidades de muestras, así como la disponibilidad de dife- rentes kits comerciales, por lo que es la prueba más utilizada. Sin embargo también muestra limitaciones, como son su poca aceptación o difícil correlación en algunas enfermedades como EDS, pneumovirus, laringotraqueitis, etc.
Sin embargo, a excepción de la seroneutralización, ninguna de las pruebas serológicas por sí mismas indica grado de protección, sino que indican el nivel de anticuerpos específicos contra un antígeno en particu- lar. Este nivel de anticuerpos debe ser racionalmente interpretado para poder decir si indica protección, expo- sición de campo o infección activa. La evaluación ruti- naria y periódica del título de anticuerpos deberá correlacionarse con los calendarios de vacunación, el comportamiento clínico y el rendimiento productivo del lote para establecer los parámetros esperados de acuerdo a la edad y a la función zootécnica de las aves para establecer los niveles considerados «normales» e inter- pretar adecuadamente las variaciones de la «normali- dad» como inmunidad insuficiente, la exposición de campo no controlada o la enfermedad clínica aparen- te. Las llamadas «líneas de base» indican el nivel normal esperado de anticuerpos en un lote a una edad determinada, permiten identificar con facilidad los cambios en el nivel de anticuerpos debidos a cambios en las vacunaciones o a exposiciones de campo y se pueden correlacionar con los objetivos de rendimien- to productivo.
En el caso de las pruebas serológicas, lo normal es que se requiera de un muestreo seriado del lote para detectar
seroconversión o bien, un incremento en el título de anticuerpos de las aves, lo cual es muy sugestivo de una exposición de campo hacia el agente evaluado.
Se ha de ser muy cauto a la hora de hacer prediccio- nes sobre títulos protectivos. En primer lugar porque el grado de protección depende de muchas variables, como las cepas vacunales utilizadas, la virulencia de las cepas de campo involucradas, el tipo de ave, el programa y método de aplicación de la vacuna y otras variables locales. Así por ejemplo, un título ELISA de 4000 frente a ND puede ser protectivo en una granja y no en otras.
Limitaciones y aplicaciones prácticas para la enfermedad de Gumboro
En el caso particular de la enfermedad de Gumboro, existen diferentes kits ELISA comerciales, cada uno de ellos con sus características especiales. Así, por ejemplo, el kit comercial seguramente más ampliamente utiliza- do, de origen americano, utiliza como antígeno el mismo que se utiliza en una vacuna intermedia clonada
Otro ejemplo es un segundo kit ELISA comercial, bastante utilizado en Europa, de origen holandés, que en condiciones normales alcanza títulos algo más altos que el primer kit mencionado, por lo que es difícil hacer comparaciones entre títulos provenientes de laborato- rios que utilicen estos 2 tipos de kits. Hay que tener en cuenta, además, que en muchas empresas e integracio- nesse empleaamenudo laconocidafórmula deDeventer, la cual proporciona una herramienta útil para estimar el momento óptimo de vacunación de un plantel especí- fico, basándose en el nivel y la vida media de los anticuerpos maternos, la edad de los pollos a la toma de muestras, los antecedentes genéticos de los pollos y la cepa de la vacuna de IBD
Pero también hay algunas diferencias entre los kits y los anticuerpos detectados. Recordemos que el genoma del virus de la enfermedad de Gumboro codifica 5 proteínas diferentes, de VP1 a VP5. Las proteínas VP2 y VP3 son las principales proteínas estructurales, que constituyen el exterior e interior de la cápside del virus, respectivamente. Los epítopos localizados en la proteína VP2 son capaces de provocar los anticuerpos neutralizantes protectivos frente al IBDV y son determi-
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nantes del serotipo. El sitio antigénico responsable de la inducción de anticuerpos neutralizantes se encuen- tra dentro de una región muy pequeña, conocida como dominio variable de VP2, y es altamente dependiente de la con- formación. Por el contrario, VP3 es un antígeno específico de grupo que es reconocida por anticuerpos no neutralizantes, que puede reaccionar de forma cruzada con los dos serotipos.
Recientemente se ha lanzado un nuevo kit ELISA, el kit PROFLOK Plus IBD Ab test
El advenimiento de vacunas de úl- tima generación contra la enfermedad de Gumboro, como son las vacunas vectoriales que por su conformación producen una respuesta de anticuerpos VP2
En varios ensayos recogidos por Prandini y col.
Fig. 3. Títulos medios de anticuerpos ELISA IBDV (± desviación estándar) en pollos vacunados con vacunas intermedias o con vacuna vectorial (De Prandini F. y col., 2008).
Fig. 4. Títulos medios de anticuerpos ELISA IBDV (± desviación estándar) en pollos vacunados con una vacuna intermedia Plus o con vacuna vectorial (SC al día 1) (De Prandini F. y col., 2008)
Fig. 5. Títulos medios de anticuerpos ELISA IBDV (± desviación estándar) en pollos vacunados con una vacuna de Inmuno Complejos o con vacuna vectorial (in ovo) (De Prandini F. y col., 2008)
Fig. 6. Títulos medios de anticuerpos ELISA IBDV (± desviación estándar) en pollitas vacunadas con una vacuna intermedia o con vacuna vectorial (SC al día 1) (De Prandini F. y col., 2008).
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durante las 2 primeras semanas de edad, la respuesta media de anticuerpos ELISA depende del tipo de vacuna administrada
Una segunda y muy importante ventaja de la vacuna vectorial es que es independiente de los anticuerpos maternos
Una última ventaja para la vacuna vectorial es que el uso combinado de los kits ELISA clásicos e IBD Plus, permite diferenciar las aves vacunadas con la vacuna vectorial de las aves infectadas o vacunadas con vacu- nas de virus vivos.
Resumen y conclusiones
•La técnica que más ampliamente se emplea en el caso particular de la enfermedad de Gumboro es la prueba ELISA.
•Los títulos ELISA conseguidos con los kits clásicos no indican grado de protección, sino el nivel de anticuerpos específicos contra un antígeno en particular.
•Para IBD existen diferentes kits ELISA comercia- les, cada uno de ellos con sus características especiales en lo referente a valores.
•Los kits clásicos aunque detectan casi todos los anticuerpos frente a las diferentes VP, sobre todo detectan los anticuerpos anti VP3.
•Un nuevo kit ELISA IBD Plus, permite una detec- ciónmásprecisadelosanticuerposVP2protectivos del IBDV y se correlaciona bien con la prueba de neutralización, la única prueba serológica que indica títulos protectivos.
•Tras la vacunación con una vacuna vectorial, con los kits ELISA clásicos la respuesta de anticuerpos es menor que los conseguidos con las vacunas vivas clásicas, pero con el kit ELISA IBD Plus, la respuesta es más temprana y mayor.
•Con el test ELISA IBD Plus, la media de los títulos de anticuerpos en los grupos vacunados con vacuna vectorial permanecieron altos desde el día 15/17 hasta los días 26/29. En contraste, en las aves vacunadas con las vacunas de virus vivos clásicas, disminuyó hasta el día 21/28 y, a con- tinuación, aumentó al día 42/45, lo que sugiere un vacío inmunitario en estas aves.
•Tras la vacunación con la vacuna vectorial no se produjo vacío inmunitario durante el período de edad de 3 a 5 semanas, el más importante para el desafío con IBDV de campo.
•El uso combinado de los kits ELISA clásicos e IBD Plus, permite diferenciar las aves vacunadas con la vacuna vectorial, de las aves infectadas o vacunadas con vacunas de virus vivos.
Referencias bibliográficas
Se enviarán a quienes las soliciten.